Espectrofotometría:
Se basa en las modificaciones producidas en el espectro de absorción de los barbitúricos cuando estos se hallan en solución fuertemente alcalina (pH10 – pH13).
La presencia de funciones ácidas fácilmente ionizables a pH13 y pH10 en la estructura química de los barbitúricos, explica su comportamiento en luz ultravioleta (UV) cuando se encuentran en soluciones alcalinas, observándose picos máximos de absorción característicos, en el rango de longitudes de onda entre 228nm y 307nm. Esta propiedad permite agruparlos en 3 categorías.
Esta es una técnica que utiliza simultáneamente dos bandas de ionización, por lo que se denomina fotometría diferencial. Es de utilidad en el caso de los barbitúricos 5-5 disustituidos, ya que los mismos no poseen sustituciones en ninguna de las funciones ácidas (NH en posición 1 y NH en posición 3) de su estructura química. De esta manera en solución fuertemente alcalina (NaOH 0,45N) a pH13, estos barbitúricos presentan un máximo de absorción a 255 nm como consecuencia de la ionización de la segunda función ácida (N1), mientras que a pH10 se observa un máximo a 240 nm, como consecuencia de la ionización de la primera función ácida (N3).
Una vez obtenidos los barridos a diferentes longitudes de onda, tanto a pH13 como a pH10, se restan las absorbancias obtenidas a pH10 de las obtenidas a pH13, observándose una curva diferencial de forma característica. La diferencia de absorción a 260 nm permite la cuantificación del barbitúrico, ya que de acuerdo al método, a esta longitud de onda no se observa interferencia proveniente de otras sustancias.
En el caso de los barbitúricos 1,5,5 trisustituidos, el hecho de poseer una sustitución en N1 impide la segunda ionización, por lo que se presenta un máximo de absorbancia a la misma longitud de onda (240 nm) tanto a pH13 como a pH10. La absorbancia a 240 nm a pH13 se empleará para cuantificar el barbitúrico.
En el caso de los tiobarbitúricos, se utiliza la lectura a 305 nm a pH13 para la determinación cuantitativa.